Cô bắt đầu sự nghiệp của mình với tư cách là một diễn viên lồng tiếng. Cô đã tham gia vào các bộ phim Mascarade và The Journey Home cũng như các sê ri phim truyền hình The Little Flying Bears, Young Robin Hood và Gulliver's Travels.

Cô chuyển tới thành phố New York vào năm 1995 nơi cô góp mặt trong một số vở kịch. Mặc dù cô đã xuất hiện trong một số phim do Canada sản xuất cuối những năm 80 đầu những năm 90, sự nghiệp diễn xuất trên truyền hình của cô bắt đầu cuối những năm 90 khi cô trở thành khách mời trong một số sê ri phim truyền hình như Viper và Seven Days. Tuy nhiên, vai chính đầu tiên của cô nằm trong Boston Public.

Sau khi xuất hiện với tư cách khách mời trong hai tập phim The Practice, Jessalyn tiếp tục tham gia vào hai tập phim Snoops. Mặc dù phim bị hủy bỏ trước khi tập phim của Jessalyn lên sóng, Kelley đã viết kịch bản của nhân vật Lauren Davis trong Boston Public dành riêng cho cô. Phim bắt đầu lên sóng vào tháng 9 năm 2000 trên FOX. Jessalyn ngừng tham gia phim sau khi mùa thứ hai kết thúc vào tháng 5 năm 2002.

Sau đó, Jessalyn thủ vai Gina Russo trong phim Nip/Tuck từ năm 2003 đến năm 2008. Cô cũng xuất hiện trong 5 tập phim NYPD Blue (2004) và 4 tập phim Prison Break (2005). Đầu năm 2006, cô trở thành khách mời trong một tập phim Law & Order.

Bên cạnh những vai diễn trong các phim truyền hình và trên sân khấu kịch, Jessalyn còn tham gia vào một số bộ phim điện ảnh. Năm 1998, cô đảm nhận một vai phụ trong The Horse Whisperervà lồng tiếng cho nhân vật Kayley trong bộ phim hoạt hình Quest for Camelot. Năm 2004 cô xuất hiện trong các bộ phim Chicks with Sticks và See This Movie. Năm 2007, cô thủ vai chính trong bộ phim Flood.

Từ năm 2007 đến năm 2008 cô có một số vai phụ trong Friday Night Lights (vai Shelley, em gái của Tami Taylor) và Heroes (vai mẹ đẻ của Meredith Gordon). Jessalyn thủ vai chính Terri Schuester trong sê ri phim truyền hình Glee của Fox từ năm 2009 đến năm 2011. Năm 2012 nhân vật của cô quay trở lại trong tập "Glee, Actually".